分光光度計是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。根據電磁輻射原理，不同的物質有不同的吸收選擇，即不同的吸收光譜。分光光度計已成為現代分子生物實驗室的常規儀器。常用于核酸、蛋白質定量和細菌生長濃度的定量。該儀器主要由光源、單色、樣品室、探測器、信號處理器、顯示和存儲系統組成。

許多化學物質都有顏色，一些無色化合物也可以與顯色劑一起生成有色物質。實踐證明，有色溶液濃度越大，顏色越深；濃度越小，顏色越淺。因此，有色溶液的濃度可以通過比較溶液的顏色深度來確定，并定量分析溶液中所含的物質?；诒容^顏色深度對溶液進行定量分析的方法稱為比較顏色分析。

分光光度法是定性和定量分析被測物質在特定波長或一定波長范圍內的吸收度。常用的波長范圍為：

(1)200～400nm紫外光區；

(2)400～760nm可見光區；

(3)2.5～25μm(波數為4000cm<-1>～400cm紅外光區-1>)。

所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計（或比色度計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精度和準確性，所有儀器應按照國家計量驗證程序或本附錄的規定進行定期校正和驗證。

包括4000波長范圍~760nm可見光區和波長范圍為200~400nm的紫外光區.不同的光源有其獨特的發射光譜，因此可以使用不同的發光體作為儀器的光源.

鎢燈發射光譜:鎢燈光源發出的400~760nm波長光譜光經三棱鏡折射后，可獲得紅橙、黃綠、靛藍、紫色組成的連續色譜；該色譜可作為可見光分光光度計的光源.

氫燈發射光譜：氫燈發射185~400nm波長光譜可作為紫外光光度計的光源.

物質吸收光譜

如果某種物質的溶液放置在光源和棱鏡之間，屏幕上顯示的光譜不再是光源的光譜。它有幾條暗線，即光源發射光譜中的一些波長光因溶液吸收而消失。這種被溶液吸收的光譜稱為溶液的吸收光譜.

不同物質的吸收光譜不同.因此，溶液中所含的物質可以通過吸收光譜來識別.

物質吸收光譜

當光通過某種物質的溶液時，光的強度減弱.由于部分光反射或分散在溶液表面，部分光被形成溶液的物質吸收，只有部分光可以通過溶液.

入射光=反射光+分散光+吸收光+透過光

如果我們使用蒸餾水（或組成溶液的溶劑）作為"空白"因反射、分散等因素造成的入射光損失：

入射光=吸收光十透過光

分光光度計采用能產生多波長的光源，通過一系列分光裝置產生特定波長的光源。測試樣品后，部分光被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化為樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

當單色光輻射穿過被測物質溶液時，被測物質吸收的量與物質濃度和液層厚度（光路長度）成正比，其關系如下：

A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc

式中:A為吸光度；

I。入射單色光強度；

I單色光強度為透射；

T物質的透射率；

k摩爾吸收系數；

L對于被分析物質的光程，即比色皿的邊長

c物質濃度

物質對光的選擇性吸收波長和相應的吸收系數是物質的物理常數。當已知的純物質在一定條件下的吸收系數時，可以在相同條件下將試驗產品分配到溶液中，以確定其吸收程度，然后從上述公式計算試驗產品中物質的含量。在可見光區域，除了某些物質吸收光外，許多物質本身并沒有被吸收，但可以在一定條件下添加顯色試劑或經過處理后進行測量，因此也稱為顏色比較分析。由于顯色影響顏色深度的因素較多，經常使用單色光純度較差的儀器，標準產品或控制產品應同時操作。

為什么溶液有顏色，為什么顏色和濃度有關？這個問題將在下面討論。

一、光的互補性和有色物質的顯色原理

1.光的波粒二象性

光是電磁波的表現形式。光線在真空中直線傳播，反射、折射、衍射、色散、干擾和偏振發生在不同的介質上。可以用波長、頻率、傳播速度等參數來描述，即光具有“波動性”。光的顏色由光的波長決定，人眼能感覺到的光稱為可見光，波長在400~750nrn之間。紅外光和紫外光除可見光外。同時，光也有“粒子性”光電效應就是一個很好的例子。光的粒子性理論認為，光是由“光子”（或稱“光量子”）所組成。當輻射能量時，光以能量E的形式輻射，當光被吸收時，能量也被吸收。每一種能量的大小是hυ。光子能量與波長的關系是E=hυ=hc／λ，E是光子的能量（J：焦耳），υ為頻率，h為普朗克常數(6).63×10-34J?S），c為光速，λ光的波長。因此，不同波長的光能量不同，短波能量大，長波能量小。

2.光的顯色原理

如果將兩種顏色的光與一定的強度比混合得到白光，則這兩種顏色的光稱為互補色。圖1中的兩種直線光是互補的顏色。如綠色和紫色是互補的顏色，黃色和藍色是互補的顏色等。

由于溶液中有色質點（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光，各種溶液呈現出不同的顏色。實驗證明，溶液呈現的顏色是吸收光的主要互補顏色。例如，當一束白光通過高錳酸鉀溶液時，大多數綠光被選擇吸收，其他光通過溶液。從互補色示意圖可以看出，透光中只有紫色光，因此高錳酸鉀溶液呈紫色。

二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律

吸收定律可以描述溶液顏色的深度和濃度之間的關系。它由朗伯定律和比爾定律組成，因此被稱為朗伯比爾定律。原子吸收分光光度計也符合這一定律。

當一束強度為I的平行單色光照射到溶液中時，部分光被溶液吸收，部分光被界面散射，其余光通過溶液，如圖2所示

有：I0=Ia+Ir+It

I0-入射光強度

Ia--吸收光強度

Ir--反射光強度

It--透射光強度

通常由于Ir它很小，可以忽略不計。上式可以簡化為

I0=Ia+It

透射光It入射光強度I0之比為透光率或透光率，用T表示：

T=It/Ia

透光率的負對數稱為吸光度、光密度或消光度，用A表示：

A=－lgT=lg1/T=lgIa/It

吸光越大，物質對光的吸收越強。透光度和吸光度都用來表示入射光的吸收程度，它們之間可以相互轉換。

實驗表明，當單色光通過有色溶液時，透過溶液的光強度不僅與溶液的濃度有關，還與溶液的厚度和溶液本身對光的吸收性能有關。其規則可以用以下模式表示A＝KCL式中：A（E）——吸光度(或光密度，也可以用D表示)；K——消光(吸收)系數；C——溶液濃度；L——光程，即溶液的厚度。

消光系數K是一個常數。有色溶液對一定波長（單色光）的入射光K值具有一定的值。如果溶液濃度以摩爾/升表示，溶液厚度以厘米表示，則此時的K值稱為摩爾消光系數。摩爾消光系數是有色化合物的重要特征之一。顯色反應的靈敏度可以根據該值的大小進行估計。

從上面的風格可以看出，當K和L不變時，光密度E與溶液濃度C成正比。也可以說，當一束單色入射光通過有色溶液并入射光時，消光系數和溶液厚度不變，吸光度A隨溶液濃度而變化。

這種單色光和有色溶液之間的關系被稱為朗伯比爾定律。光電比色計和分光光度計的比色分析是基于這一定律。然而，朗伯比爾定律只適用于單色光和低濃度的有色溶液。

三、應用朗伯-比爾定律

1.等吸光法

從朗伯比耳定律可以看出，當同一光源照射同一物質的不同濃度溶液時，如果吸光度相等，則兩種溶液的濃度和透光層厚度的乘積也相等。利用這種關系，可以在可見光區找到待測溶液的濃度（視覺色法）。

2．計算法

根據測量溶液濃度的一般范圍，首先制備已知濃度的標準溶液。用同樣的方法處理標準溶液和測量溶液，在相同的實驗條件下用相同的儀器測量其吸光度。

標準溶液：As=KsCsLs

待測溶液：Ax=KxCxLx

如果在測量時選擇相同厚度的比色皿使L相等，并使用相同波長的單色光來保持相同的溫度，則K也相等。除去兩種類型As/Ax=Cs/Cx

由此可見，在滿足上述條件下，吸光度與溶液成正比。如果設計儀器可以測量吸光度A值，則可以在測量溶液濃度后找到Cx=Ax/As?Cs

由于儀器的性能和實驗環境不斷變化，在采用計算方法時，必須每次測量標準液和測量液，然后使用上公式計算，否則會帶來較大的測量誤差。

由于一般光電比色計在結構上偏離了朗伯一比耳定律，因此經常采用標準曲線法獲得更準確的結果。

3.標準曲線法

該方法分為以下步驟：

(1)先準備五種以上標準濃度的溶液。

(2)測量每種溶液的吸光度A。

（3）做A～C如圖3所示，標準曲線圖。

溶液可以用標準的工作曲線來測量。在相同的條件下，用儀器測量A后，檢查標準曲線以獲得測量溶液的濃度值Cx。

由于光電比色計工作在可見光區域，僅適用于在有限波長下測量，且波長的半寬度較大。因此，它不能滿足不同分析工作的需要。其次，光電比色計的靈敏度也較低。為了克服上述缺點，開發了一種更好的性能分析方法：紫外分光光度法。采用單色光純度高，波長范圍寬，可連續變化，解決光電比色計存在的問題。